Изображение показывает проекции максимальной интенсивности нейронов через часть мозга мыши.
Тонкие ветвящиеся усики, которые отходят от нейрона, часто проходят большие расстояния, чтобы сформировать связи со своими клетками-мишенями. Отслеживание этих связей – основная цель ученых, которые хотят понять, как именно мозг обрабатывает информацию, но технические препятствия мешают усилиям. Теперь ученые из исследовательского кампуса Janelia при Медицинском институте Говарда Хьюза проследили полные пути нескольких нейронов через весь мозг мыши, используя технологию, которую, по их словам, можно масштабировать, чтобы обеспечить более масштабные усилия по картированию.
Многопрофильная проектная группа ученых Janelia сообщает о разработке новой платформы визуализации, которая сочетает в себе высокоскоростной световой микроскоп с высоким разрешением с новыми методами подготовки образцов и мощным программным обеспечением для обработки изображений для эффективного картирования проекций нейронов клетка за клеткой. Они опубликовали свое исследование онлайн 20 января 2016 года в журнале eLife. "В прошлом было очень сложно идентифицировать цели отдельных нейронов," говорит Майкл Экономо, научный сотрудник Janelia, который является первым автором публикации. "Этот микроскоп действительно должен сделать этот процесс более эффективным."
Публикация включает в себя реконструкции пяти нейронов, которые распространяются по мозгу мыши в виде сложных и разнообразных паттернов, что представляет собой веху для команды проекта MouseLight Project Жанелии, целью которой является создание карт проекций нейронов по всему мозгу мыши.
"Цель проекта – увидеть, куда отдельные нейроны мозга отправляют свои сообщения, и сделать это в большом масштабе," говорит руководитель проекта Джаярам Чандрашекар. В конечном итоге, говорит он, команда MouseLight стремится отслеживать проекции тысяч нейронов, небольшой процент из 70 миллионов нейронов в мозгу мыши, но огромный рост по сравнению с горсткой проекций, которые были реконструированы на сегодняшний день. "Сделать это," он говорит, "нам нужно иметь возможность отслеживать отдельные нейроны прямо от их клеточного тела до их концов, поэтому нам нужно очень хорошее разрешение, и нам нужна скорость. Современные технологии позволяют нам делать и то, и другое."
Хотя ученые начинают определять, как разные области мозга мыши соединяются друг с другом, они плохо понимают межклеточные вариации, которые существуют в этих более широких связях. "Существует большая загадка о том, сколько существует типов проекций, и эта проблема решалась очень поэтапно," говорит Карел Свобода, руководитель группы Janelia, который помогал руководить разработкой проекта MouseLight.
Отслеживая проекции значительного процента клеток в головном мозге, команда рассчитывает многое узнать о том, как нервная система обрабатывает информацию. "Поле проекции нейрона сложное, но очень специфичное, и оно по сути определяет, куда этот нейрон отправляет информацию," Свобода говорит. "Таким образом, знание формы нейрона в мельчайших подробностях говорит нам о том, как сигналы направляются в мозг."
Работа по картированию нейронов началась в лаборатории бывшего лидера группы Джанелии Джина Майерса, ученого-информатика, который сейчас работает в Институте молекулярной клеточной биологии и генетики им. Макса Планка. В 2010 году Натан Клак, ученый из лаборатории Майерса (ныне в Vidrio Technologies), решил применить методы анализа изображений, разрабатываемые в лаборатории Майерса, к проблеме отслеживания нейронов в мозге мыши.
"Очень сложно сфотографировать целый нейрон," Клак говорит. "Аксон – рабочий конец нейрона – похож на тонкую проволоку диаметром всего 80 нанометров, которая перемещается на несколько сантиметров." По его словам, чтобы запечатлеть тонкие расширения нейрона от начала до конца "вам действительно нужно подумать о визуализации всего мозга."
Таким образом, первым приоритетом Клэка была оптимизация микроскопа с высоким разрешением для этой задачи. Работа с дизайном инструментов Джанелии & Производственная группа, он адаптировал двухфотонный микроскоп – технологию, которая позволяет ученым получать четкие изображения под поверхностью ткани – для значительного увеличения скорости визуализации. Даже с улучшенной скоростью микроскопу все равно потребуется больше недели, чтобы получить полное изображение мозга мыши, поэтому Clack разработала управляющее программное обеспечение для полной автоматизации процесса.
Затем Клак объединился с Чандрашекаром и Экономо, чтобы разработать метод подготовки мозга мыши к визуализации. Мозговая ткань затуманивается жирами, которые закрывают вид под поверхностью, поэтому, если эти жиры не удалены, ткань необходимо разрезать на ультратонкие срезы для получения изображений с высоким разрешением. Этот процесс, который может деформировать ткань, затрудняя восстановление изображений структур, которые проходят через многие срезы. Существующие методы удаления жиров были несовместимы с длительным периодом визуализации, поэтому руководитель группы Janelia Люк Лавис, химик, применил свой опыт для решения этой проблемы. В конечном итоге команда разработала мягкую стратегию очистки, которая позволяет микроскопу четко отображать до 250 микрон под поверхностью образца. "Такой подход сохраняет флуоресценцию [меченых нейронов] и дает нам действительно высококачественные данные," Клак говорит.
Чтобы сгенерировать изображения, которые они будут использовать для отслеживания проекций нейронов, Экономо и его коллеги применили свой протокол очистки к мозгу мыши, в котором небольшое количество нейронов было ярко помечено флуоресцентным красителем. Они вставили этот мозг в микроскоп, и после некоторой начальной настройки началась автоматическая визуализация.
Чтобы получить изображение всего мозга, микроскоп собирает около 20000 отдельных, но перекрывающихся блоков изображений, визуализируя их настолько глубоко, насколько это возможно, затем срезает слой ткани и повторяет процесс. Весь мозг отображается в виде примерно 100 срезов – процесс, который занимает около 7-10 дней и генерирует десятки терабайт данных. Используя преимущества методов, разработанных научной вычислительной группой Жанелии для управления большим объемом данных, 20 000 блоков изображений в конечном итоге сшиваются вместе с помощью вычислений, чтобы сформировать полное трехмерное представление мозга.
Последний шаг, отслеживание путей флуоресцентно меченых нейронов для генерации окончательных реконструкций проекций каждой клетки, был выполнен вручную, что потребовало от 40 до 60 часов работы на каждую клетку. В настоящее время команда изучает способы значительного сокращения времени, которое необходимо посвятить этой задаче, работая над улучшением маркировки ячеек и вычислительного анализа, чтобы трассировка могла выполняться в основном автоматически. "Этот шаг никогда не будет полностью автоматизирован, но мы считаем, что его можно сократить до нескольких часов," Чандрашекар говорит. Это будет важно, поскольку команда работает над тем, чтобы использовать свою платформу для выполнения примерно одной нейрональной реконструкции в день.